Какой криопротокол лучше: Удачный криопротокол после неудачного ЭКО – отзывы ✔️

Разница между криопротоколом и полным циклом ЭКО


Полный цикл экстракорпорального оплодотворения подразумевает несколько этапов: стимуляцию суперовуляции мощными гормональными препаратами, пункцию фолликулов под наркозом, внедрение сперматозоидов в ооциты, культивирование эмбрионов, перенос их в матку. Протокол с криоконсервированным материалом считается более щадящим, поскольку включает в себя только перенос размороженных эмбрионов.

Стоимость, питание и ощущения


Цикл с переносом криоконсервированных эмбрионов обходится гораздо дешевле, чем классическая процедура ЭКО. Во-первых, в нём меньше этапов. Во-вторых, требуется не так много препаратов (не нужно проведение терапии с использованием фолликулостимулирующих инъекций). В криоцикле, где назначена заместительная гормональная терапия, нужны витамины, лекарства для разжижения крови и препараты, помогающие уравновесить уровень эстрадиола и прогестерона. Нередко криопротокол проводится в естественном цикле, в таком случае назначаются только витамины и минимальная доза препаратов прогестерона для поддержки второй фазы цикла. В-третьих, для проведения криопереноса эмбрионов готовят только организм пациентки. Мужчина не проходит исследование, как в случае в полноценным циклом экстракорпорального оплодотворения.


Диета при классическом ЭКО и криопереносе также разнится. В первом случае женщина должна употреблять как можно больше белковой пищи (она служит источником питательных элементов для новых клеток и помогает организму на этапе стимуляции суперовуляции), отказаться от продуктов, которые вызывают повышенное газообразование (в противном случае может возникнуть ощущение тяжести в животе, что усугубит неприятные ощущения от увеличивающихся в размере яичников). Диета в цикле с замороженными эмбрионами подразумевает лишь отказ от продуктов, тяжелых для пищеварения конкретной пациентки.


Протокол с криопереносом не доставляет женщине неприятных ощущений, ведь не нужно делать многократные уколы в область живота и бедер, переживать наркоз и пункцию, нет ощущения раздутости, отсутствует риск гиперстимуляции. Посещать врача нужно реже — в среднем три раза до переноса (в коротком протоколе ЭКО — пять и более).

Различается ли результативность?


Каждый третий протокол завершается наступлением беременности — это общемировая статистика. При этом нет существенных различий в том, был это цикл с криопереносом или стимулированный. А вот рисков отмены трансфера эмбрионов в первом случае меньше. Во-первых, отсутствуют предпосылки для развития гиперстимуляции, на фоне которой перенос невозможен. Во-вторых, эмбрионы гарантированно сильные (замораживают только тех, которые имеют потенциал для дальнейшей разморозки). Из криосна успешно выходят до 99 % эмбрионов, это означает практически полную гарантию осуществления трансфера. В стимулированном цикле при слабом отклике яичников или сильном мужском факторе, например, можно получить всего пару нежизнеспособных эмбрионов. Протокол в таком случае оказывается незавершенным, перенос не назначается.


Имплантационное окно одинаково предсказуемо в стимулированном цикле ЭКО и в криопротоколе на заместительной гормональной терапии. Нет разницы между открытием этого окна и в протоколах, которые проводятся в естественных циклах. Поэтому с точки зрения простоты поиска идеального момента для переноса они одинаковы.

Объем обследований для женщины


Перед процедурами в обоих случаях нужно посетить ряд специалистов (репродуктолога и гинеколога в Краснодаре, терапевта), сдать анализы крови (на инфекции, ЗППП, гормоны, общий, клинический), мазки и бактериологические посевы, сделать пайпель-биопсию, флюорографию, ЭКГ, УЗИ органов малого таза, щитовидной и молочных желез. Лечащий врач может назначить дополнительные обследования, гистероскопию, лапароскопию.


Что точно не понадобится перед криотрансфером, так это анализ крови на антимюллеров гормон. Он позволяет оценить овариальный резерв, эта информация при наличии эмбрионов не нужна.


Если вы планируете экстракорпоральное оплодотворение, обращайтесь к нам. Наша клиника проводит прием репродуктолога и гинеколога в Краснодаре в воскресенье.

Криопротокол ЭКО — цена, схема, подробно по дням

Здравствуйте, Ирина, восстановить проходимость маточных труб практически невозможно. Всё дело во внутреннем слое, который выстилает маточные трубы — он имеет специальные «ворсинки», которые помогают оплодотворенной яйцеклетке продвигаться в матку для имплантации и дальнейшего развития. Именно этот слой врачи и ученые еще не научились восстанавливать, поэтому чаще всего после лапароскопии, даже если наблюдается появление проходимости труб, фактически они не функциональны, и самостоятельная беременность маловероятна. Мои рекомендации — готовиться к ЭКО, не прекращая самостоятельных попыток забеременеть (шансы крайне низкие, но не нулевые).
При этом учитывайте высокие риски внематочный беременности при классическом зачатии — если трубы плохо проходимы, но полностью не закрыты, то сперматозоид пройти в трубу и оплодотворить яйцеклетку может, а вот плодное яйцо, которое по размерам гораздо больше сперматозоида, имеет все шансы «застрять» в маточной трубе. Поэтому если в процессе подготовки к ЭКО у вас случится самостоятельная беременность (задержка менструации, тесты и пр.), то через неделю после задержки необходимо прийти на УЗИ, чтобы убедиться, что плодного яйца в маточной трубе нет.
Непроходимость маточных труб никак не влияет на овариальный резерв или качество яйцеклеток. Однако рекомендую вам поторопиться с посещением репродуктолога. К 35 годам у женщины уменьшается количество яйцеклеток в каждом цикле и ухудшается их качество, а значит, снижаются шансы на беременность с первого протокола ЭКО. Перед приемом супругу желательно сдать спермограмму у нас в Центре и принести с собой на прием.
Я работаю в Центре по адресу: м Славянский бульвар, Можайское шоссе, 16. Для записи на прием позвоните по нашему телефону или оставьте заявку на сайте (форма или онлайн чат), вам пререзвонят. Спасибо!
Анна Александровна Ильина, заведующая отделением ВРТ, репродуктолог
ООО «Центр репродукции «Линия Жизни»
www.life-reproduction.ru
[email protected]
+7(495)668-61-71

Криопротокол при ЭКО в Москве


Показания для проведения ЭКО со стимуляцией и криопротоколом


Программа «ЭКО со стимуляцией и протоколом» показана пациентам, которым требуется отложить перенос эмбрионов либо провести их предварительную генетическую диагностику.

Показания к программе:

  • повышенный риск синдрома гиперстимуляции яичников;
  • случаи невынашивания беременности в анамнезе;
  • необходимость подготовить эндометрий к имплантации эмбриона;
  • наследственная тромбофилия;
  • использование витрифицированных в прошлом эмбрионов;
  • запланированное генетическое исследование эмбрионов до момента переноса (ПГД).

Подготовка к ЭКО со стимуляцией и криопротоколом

Подготовка к программе проходит по той же схеме, что и обследования перед ЭКО со стимуляцией. Если эмбриотрансфер запланирован на следующий после проведенной стимуляции менструальный цикл, то большинство лабораторных анализов еще действительны. В отдельных случаях лечащий врач может назначить дополнительное исследование.

Проведение процедуры ЭКО со стимуляцией и криопротоколом

Программа начинается со стимуляции овуляции и прерывается на этапе витрификации эмбрионов. Затем мы делаем временной перерыв, и в назначенное репродуктологом время, эмбрионы размораживают и переносят в полость матки. Решение о моменте эмбриотрансфера врач принимает с учетом оценки состояния готовности репродуктивной системы пациентки и ее организма в целом. Обычно перерыв после стимулированного цикла составляет два месяца.

Мы практикуем два варианта криопереноса: в естественном цикле и на заместительной терапии гормонами. Оптимальное решение принимает лечащий врач.

В первом случае назначение препаратов минимально, а эмбриотрансфер проводится в условиях, близких к физиологическим, под тщательным контролем овуляции и роста эндометрия. Криоперенос в естественном цикле мы, как правило, назначаем пациенткам раннего репродуктивного возраста и регулярным овуляторным циклом.

Криоперенос на заместительной гормональной терапии рекомендуется женщинам позднего репродуктивного возраста, со сниженным овариальным резервом и нерегулярным менструальным циклом, для управления которым мы используем гормональные препараты. В этом случае мы назначаем пациентке прием эстрогенов для роста эндометрия, который контролируем по УЗИ. Когда поверхность эндометрия достигает уровня, благоприятного для имплантации эмбриона, эстрогены заменяются на препараты прогестерона и выполняется эмбриотрансфер. Для облегчения имплантации мы проводим вспомогательную процедуру — хэтчинг, во время которой надсекается оболочка эмбриона.

Спустя 14 дней после переноса эмбриона пациентке в рамках программы выполняется тест на беременность посредством сдачи анализа крови на в-ХГЧ.

Программа «ЭКО со стимуляцией и криопереносом» занимает минимум два менструальных цикла.

Для получения подробной информации о программе и записи на прием к репродуктологу звоните по телефону (495) 777-48-49.

Криопротокол при ЭКО — «Три крио с разными протоколами: ЗГТ и ЕЦ. Инструкция транспортировка криоэмбрионов своими силами из клиники в клинику. Много фото из личного архива + Улучшение качества ЯЦ»

Мой первый криопротокол проходил в клинике ПМЦ, в ЕЦ (естественном цикле), т.е. без гормональной поддержки и моделирования цикла, мы ловили свою овуляцию и переносили эмбрион, опираясь на анализы гормонов по крови и УЗИ полости матки (состояние эндометрия и его размер), протокол был медикаментозно таким:

1 крио Мать и дитя ПМЦ

1 крио Мать и Дитя ПМЦ

Рекомендации после переноса эмбриона такими:

1 криопротокол

УЗИ 1

1 криопротокол

Пролет увы, БХБ (биохимическая беременность)

пролет 1 крио

Второй крио-протокол проходил у меня в клинике НОВА КЛИНИК. Для этого мы своими силами перевезли на машине с мужем наши эмбрионы из одной клиники в другую, я хочу поделиться этим опытом и написать инструкцию, как и что надо делать по пунктам.

Я знаю, что многие пары платят за перевоз эмбрионов из одной клиники в другую специальным службам, якобы никто кроме них не может осуществлять эту манипуляцию, но это не так. Если транспортировка происходит в рамках одного города, вам достаточно личной машины или такси и часа личного времени. Это не сложная и БЕСПЛАТНАЯ процедура, с которой может справиться каждая пара.

Инструкция ПЕРЕВОЗ криоэмбрионов из клиники в клинику САМОСТОЯТЕЛЬНО (бесплатно):

  1. В клинике куда собирается перевозиться био-материал вы можете на прокат взять специальный металлический контейнер (визуально это как колба термоса из металла с широким горлом)

    именно в нем в жидком азоте вы повезете соломинки с эмбрионами (как криоконсервировать эмбрионы: по два или по отдельности в соломинках (это в чем именно эмьрионы храняться) — эти и другие тонкости вы решаете с эмбриологом в свежем протоколе стимуляции, обычно принято криоконсервировать каждую бластоцисту отдельно, но могут быть нюансы, если к концу культивации остается морула, ее могут криоконсервировать вместе с бластоцистой, например). В кассе вы оставляете денежный залог, и забираете контейнер, когда будете возвращать, залог вам вернут, т.е. процедура полностью бесплатна.

  2. В клинике откуда забираете эмбрионы присылаете письменный запрос (его вам даст клиника получатель), где будут перечислены документы, которые нужно будет самой клинике подготовить

    Вопрос почему и зачем вы хотите забрать вашу собственность: биоматериалл — ваша собственность, никому объяснять и доказывать не надо, достаточно просто вашего волеизьвления, ибо хранение эмбрионов услуга платная и вы ее можете осуществить где удобно вам.

    ❓ЮРИДИЧЕСКИ: А имеют ли право пациенты САМИ перевозить эмбрионы или для этого нужны ТОЛЬКО лицензированные службы для перевоза?

    Правильный ответ: и так и так можно.

    Цитаты вам в помощь

    Приказ Минздрава РФ от 30.08.2012 г. № 107н «О порядке использования ВРТ, противопоказаниях и ограничениях к их применению»:

    «п. 50. транспортировкой эмбрионов, половых клеток (сперматозоиды, ооциты) и тканей репродуктивных органов человека могут заниматься только лицензированные медицинские организации, имеющие соответствующее право на выполнение конкретных работ и оказание услуг

    п.52. по письменному заявлению пациента криоконсервированные половые клетки, ткани репродуктивных органов и эмбрионы выдаются на руки пациенту.»

  3. К оговоренной дате и времени приезжаете с ПУСТЫМ контейнером в клинику, отдаете его эмбриологу.
  4. Оформляете все официальные бумаги, проверяете все заполнение о наличие всех документов из списка:

    Количество эмбрионов лучше оговорить заранее, я сначала хотела перевести часть, но в последний момент передумала и забрала все. Оплачиваете хранение эмбрионов в этой клинике по факту, либо получаете назад деньги, если оплата была авансом…

  5. Вам выносят ваш контейнер с эмбрионами, из которого как будто слегка сочится пар сверху, Это нормально, плотно закрывать крышку не надо азот должен «дышать», он не вытечет весь, не волнуйтесь.И едите в новую клинику, держа контейнер вертикально в руках не сильно его тряся, но и не трясясь над ним:
  6. В клинике, куда вы переводите эмбрионы, вы отдаете контейнер эмбриологам и передаете все бумаги с ними, оплачиваете хранение, возвращаете обратно контейнер и забираете залог за него.

Вот и все! все это укладывается примерно в час вашего времени.

Процедура абсолютно не опасная, и лишь слегка волнительная.

Итак, второй криопротокол у нас был в новой клинике в ЕЦ

УЗИ 2

крио 2

И снова, пролет 2: БХБ (биохимическая беременность)

пролет 2

Третий криопротокол у нас проходил там же, но на ЗГТ (замесительная гормональная терапия)

. ..я поснимала палату, если любопытно:

УЗИ 3

3 крио

К сожалению, мой третий криопротокол тоже закончился пролетом…

Плюсы:

  1. Не большая гормональная нагрузка на организм (если перенос эмбриона в ЕЦ, и даже на ЗГТ)
  2. Отсутствие наркоза и операции пункция ооцитов (самое главное и основное)
  3. Отсутствие стимуляций (уколов в живот) и как следствие проблем со свертываемостью крови и стресса
  4. Больший процент удачи имплантации эмбрионов на криопротоколе в сравнении со свежем протоколом (со стимуляцией), частная практика уходить в крио, чтобы организм матери отдохнул и исключить проблемы со свертываемостью крови
  5. Есть возможность провести анализ ПГД (преимплантационная генетическая диагностика)
  6. Сейчас на криопротокол тоже можно получить квоту и сделать его БЕСПЛАТНО.

Обещанный подарок:

Желаю удачи и деток в вашу семью, как можно скорее!!!

Возможно вас заинтересуют мои отзывы о детской тематике:

Криопротокол — Evaclinic IVF


Главное отличие криопротокола от обычного протокола ЭКО в отсутствии этапов гормональной стимуляции и пункции яичников. В криопротоколе в матку переносят размороженные эмбрионы, которые хранились в криоконсервированном виде. Здесь Вы можете ознакомиться с информацией на сайте.


Откуда берутся эмбрионы? Благодаря гормональной стимуляции в рамках протокола ЭКО, у женщины созревает много фолликулов (в среднем от 8 до 15). Лучшие из них отбираются для последующего оплодотворения, и это дает возможность получить сразу несколько эмбрионов. В одном протоколе в матку можно перенести 1-2 эмбриона (для женщины до 35 лет) и 1-3 эмбриона (для женщины старше 35 лет). Оставшиеся эмбрионы пара может заморозить для последующих попыток.


Эмбрионы консервируются с помощью современной технологии – витрификации. Это ультрабыстрая заморозка, при которой кристаллы льда просто не успевают образоваться, а значит процент выживаемости эмбрионов при оттаивании превышает 90%.


Главные этапы криопротокола:


Обследование женщины (конкретный список будет зависеть от того, сколько времени прошло с предыдущей попытки, возможно, придется пересдавать только часть анализов).


Подготовка к переносу эмбрионов (криопротокол может проводиться, как в естественном цикле, так и с назначением гормональной терапии. Этот вопрос репродуктолог решает индивидуально для каждой клиентки).


Размораживание эмбрионов.


Перенос эмбрионов в полость матки.


Гормональная поддержка лютеиновой фазы (для поддержки беременности женщине дополнительно назначают прием препаратов прогестерона).


Проведение теста для определения беременности (анализ на ХГЧ можно сдавать уже на 10 день после подсадки, а вот тест лучше делать в первые дни задержки).


Важно: эффективность криопротокола в целом сопоставима с протоколами, в которых в матку переносят «свежие» эмбрионы. Более того, последние исследования показали, что шансы наступления беременности в криопротоколе немного выше, поскольку для криоконсервации выбираются самые жизнеспособные и крепкие эмбрионы.


Узнать подробности о криопротоколе и записаться на консультацию к репродуктологу Вы можете на сайте или по телефону 409.

Виды криопротоколов. | Жизнь женщины

Менструальный цикл, в котором под контролем врача репродуктолога в матку переносят размороженный эмбрион, полученный ранее в протоколе ЭКО, называется криопротоколом. А сам перенос – криопереносом.

Хранение криозамороженных эмбрионов

Криопротоколы бывают двух видов – в естественном цикле, и в цикле с заместительной гормональной терапией (НА ЗГТ).

Криоперенос в естественном цикле (в ЕЦ) может быть только в случае наличия своей собственной овуляции. Тогда необходимо отследить овуляцию и на пятый день после нее разморозить эмбрион и перенести в матку.

Криоперенос на ЗГТ иногда выполняется даже если есть своя овуляция, поскольку врачу удобнее контролировать весь процесс и не нужно ловить пик лютеинизирующего гормона (ЛГ), предшествующий овуляции и саму овуляцию. Минусом криопереноса на ЗГТ является сгущение крови из-за приема эстрогенов, поэтому врач сразу же назначает антикоагулянты и/или низкомолекулярные гепарины.

Как и в свежих протоколах ЭКО, криопротоколы на ЗГТ могут быть длинными и короткими, длинный начинается заранее – на 20-22 день цикла, предшествующего переносу эмбриона. Короткий — со второго дня цикла.

Уровни гормонов прогестерона и эстрогена по дням цикла

Как видно на картинке, в первую фазу цикла сразу после окончания менструации начинает расти гормон эстроген, а после овуляции – гормон прогестерон. Поэтому в криопротоколе на ЗТГ примерно на 2-3 день цикла назначаются препараты эстрогенов. Как только толщина эндометрия будет достаточной – подключают препараты прогестерона, и на 5 день их приема выполняется перенос. Этими двумя гормонами имитируется естественный цикл. Врачу нужно следить только за эндометрием – его толщиной и структурой, чтобы назначить день переноса.

Количество посещений врача в криопротоколе на ЗГТ или в ЕЦ сильно не отличается – это примерно 3 посещения для мониторинга и одно – для самого переноса. Тем не менее, в криопротоколе в естественном цикле все несколько сложнее и для врача, и для пациента… Чтобы отследить овуляцию – с 10 дня дважды в день женщина делает тесты на овуляцию, и как только вторая полоска начнет ярчать – сдаем кровь на ЛГ. Если он высокий , значит в течении 48 часов произойдет овуляция. Через 2 дня нужно сделать фолликуломентрию, чтобы увидеть, появилась ли свободная жидкость в позадиматочном пространстве и началось ли образование желтого тела на месте лопнувшего фолликула. Если этого еще не произошло – придется делать УЗИ и на следующий день до подтверждения овуляции.

Овуляторный период и пик ЛГ

Если овуляция не произойдет сама – то в этом цикле осуществлять перенос эмбриона не эффективно, нужно ждать следующего цикла. Поэтому по некоторым признакам (например, низкий пик ЛГ) или даже просто для подстраховки врач в день предполагаемого пика может назначить триггер овуляции, чтобы она точно произошла (делается укол чаще всего ХГЧ). А если пик лютеинизирующего гормона высок – то врач может принять решение, что подтверждение овуляции на УЗИ не требуется, но перед переносом, конечно, еще раз в этом убедится.

После переноса эмбриона, даже если он выполнен в естественном цикле, назначаются препараты прогестерона в качестве поддерживающей терапии.

Мой опыт: у меня был один криоперенос на ЗГТ, и один в естественном цикле. В криопротоколе в естественном цикле была биохимическая беременность (то есть в период между переносом эмбриона и назначенным днем сдачи ХГЧ он сначала вырос, а потом упал). Сейчас я снова в криопротоколе, начали мы его в естественном цикле, но на 10 день цикла врач приняла решение все-таки добавить эстрогенов. Так что все индивидуально, и только Ваш врач знает, как лучше действовать в криопротоколе.

рекомендации и секреты успеха , Клиника Пасман

Насколько будет успешно ваше экстракорпоральное оплодотворение? Вероятность положительного результата при ЭКО зависит от множества факторов – среди них и грамотная подготовка родителей к процедуре, и всестороннее исследование крошек-эмбрионов, и даже работа с психологическим настроем мамы. Что и как нужно сделать, чтобы ЭКО точно привело к желанной беременности, знают в «Клинике Пасман».

Сначала немного статистики

Общемировые данные таковы: беременность в результате ЭКО наступает в 35% случаев. В «Клинике Пасман» в некоторые месяцы этот показатель достигает 88%, в остальные – уверенно держится на достойных отметках.

Самой взрослой мамочке, родившей в результате экстракорпорального оплодотворения в «Клинике Пасман», 48 лет. Самой юной едва исполнилось 19.

Всего у пациенток клиники благодаря усилиям врачей появилось 2056 малышей. Крепкие мальчики и красавицы-девочки, двойни и даже тройняшки!

Многие роды были естественными и лёгкими. Можно и повторить – так думают те женщины, которые возвращаются сюда снова за новой беременностью и для встречи с ещё одним желанным ребёнком.

Почему всё так происходит? Почему ЭКО в клинке так успешно? Почему заветные 9 месяцев текут как праздник и вынашивание становится приятной задачей даже для мамочек старше 40 лет? Почему детки рождаются абсолютно здоровыми, а женщины готовы повторить свой опыт – и снова с этими же докторами?

А вот почему.

Тщательное обследование – залог успеха

Рождение ребёнка – настоящее чудо, и если мы хотим стать волшебниками, нужно потрудиться.

Хотя вот, например, будущему отцу можно не слишком напрягаться – достаточно лишь раз отправить в лабораторию свои «мужские чары». Анализ семенной жидкости укажет на отсутствие инфекций и выявит целостность ДНК сперматозоидов – это важно для передачи генетического материала потомству. Доктор под микроскопом выберет «красавчиков» с правильной морфологией, а исследование подвижности выявит аутсайдеров и чемпионов. Лучшие сперматозоиды удостоятся чести принять участие в протоколе ЭКО.

Если спермограмма или тест на фрагментацию обнаружат отклонения, будущий отец отправится к врачу-андрологу. Доктор составит эффективный план лечения. «Супруг обязательно должен быть пролечен. От него на 50 % зависит успех»,- сообщает Воронова Наталья Владимировна, акушер-гинеколог «Клиники Пасман».

Женский организм – инструмент более тонкий. Поэтому будущей маме предстоит пройти обширное обследование – сдать анализы, произвести УЗИ брюшной полости, щитовидной железы, молочных желёз, чтобы исключить наличие образований. При подозрении на патологию эндометрия, которым выстлано ложе для будущего малыша, стоит сделать гистероскопию. Руководить процессом будет терапевт. Узкие специалисты подключатся при необходимости – благо, в «Клинике Пасман» их целая команда, которая всегда начеку.

Параллельно думаем о вынашивании: чтобы оно было максимально простым и лёгким, решаем вопрос гипертензии (кроме терапевта будет полезен взгляд кардиолога), лечим ожирение (с помощью диетолога клиники), разбираемся с миопией (поможет офтальмолог).

Обнаружена проблема? Решение обязательно есть, и оно быстрое: устранить факторы, способные воспрепятствовать появлению малыша – в планах, а потом на свет – в «Клинике Пасман» сумеют всего за 2-3 женских цикла.

«У нас есть конкретный срок – один год. За это время мы должны понять, почему в эту семью ребёнок не приходит, пролечить имеющиеся заболевания и запустить беременность. В идеале, ещё и родить,- улыбается доктор Воронова.

— Если проблема со здоровьем более-менее решаемая, например, у мужчины снижена активность сперматозоидов, а у женщины овуляция идёт нерегулярно, то проводим искусственную инсеминацию, стимулируя и его, и её». Современная стимуляция, которую применяют в «Клинике Пасман», очень ненавязчива. Можно, например, поставить всего один укол тончайшей иглой и закончить на этом!

Лучшие клетки мамы дадут эмбриону силу вырасти и крепко «зацепиться» в цикле ЭКО

Но бывает так, что инсеминация – не ваш вариант. Тогда концентрируемся на методе экстракорпорального оплодотворения.

У обследованной, вылеченной, подготовленной мамы важно взять самые хорошие яйцеклетки. Минимум стресса, максимальный комфорт – вот кредо «Клиники Пасман». Здесь разгадали секрет: чем спокойнее женщине, чем более она расслаблена, тем лучше пойдёт любой процесс, связанный с созданием новой жизни. Поэтому зрелые ооциты добывают из яичников абсолютно безболезненно под общим наркозом.

Наркоз внутривенный и лёгкий, абсолютно безопасный: дарит эффект освежающего сна и не сказывается на работе сердца, лёгких, печени и других органов. Находиться под анестезией предстоит всего 20-30 минут, после которых можно проснуться и отправиться домой с мечтами о долгожданном пополнении и мыслями о счастливом будущем, которое наступит уже очень скоро!

Возрастные мамы – у них высокие шансы!

Свои здоровые яйцеклетки это хорошо. Поэтому в «Клинике Пасман» очень рады пациенткам, пришедшим за вторым, третьим, а то и четвёртым малышом – ведь врач без долгих разговоров может сделать вывод о 100 % фертильности мамочки.

Если детей никогда не было, а возраст женщины приближается к зрелому (около 45 лет), то, чтобы повысить шансы на успешное ЭКО, вам предложат подстраховаться клетками донора. Банк донорских ооцитов в «Клинике Пасман» — это обширная база отборных генов. Донор не подбирается наугад: есть возможность запрограммировать внешний вид, группу крови.

«Конечно, если есть хоть какой то шанс, мы всегда даём возможность попробовать свои яйцеклетки, — успокаивает врач Наталья Владимировна Воронова.- Потенциальная мамочка идёт в протокол, берём её ооциты (хоть и получается извлечь всего 2 или 3 качественных штучки) и добавляем донорские. А там смотрим, чьи эмбрионы выросли.

Если и те, и те, то тут зависит от желания пациентки. Одни хотят разнести эмбриончиков на разные циклы и сначала попробовать со своими. Другие решают подсадить сразу всех – так комфортнее в психологическом плане, ведь считать родным того малыша, который «зацепится», потом проще.

Как детки получаются такими здоровыми – вот и ответ

Сразу развеем миф: гормональная стимуляция, которой подвергается мама, никак не отражается на эмбрионе. Стимулируется только рост фолликула, яйцеклетка же остаётся ваша, родная, никем не тронутая.

То же самое и даже нагляднее происходит в случае ЭКО в естественном цикле – когда медикаменты практически не применяются, а яйцеклетка созревает самостоятельно и в комфортный организму срок.

В любом случае яйцеклетку проверяют на «профпригодность».

В том случае, если ооцит поступает от донора, его качество также проверено от и до. Женщина, у которой проводился забор, полностью обследована и здорова. Более того, по правилам донорской программы, она уже сама рожала здоровых, крепких, умненьких деток и тем самым подтвердила своё право вам помочь.

О папиных сперматозоидах мы уже рассказали – из всей массы выбираются самые первоклассные!

«Вишенка на торте» — прегравидарный скрининг: диагностика эмбриона ещё до подсадки в материнское лоно. Биопсия всего одной клетки способна подтвердить отсутствие хромосомных патологий. Так что теперь пары, решившие стать родителями в зрелом возрасте, могут быть спокойны за здоровье будущего ребёнка. Так же нет повода волноваться тем, у кого в роду присутствовали генетические аномалии, — вам перенесут заведомо здоровый эмбрион, который через 9 месяцев станет розовощёким улыбчивым малышом!

Кстати, прегравидарный скрининг делает шанс на успешное ЭКО куда ощутимее. Больше никаких попыток «вслепую»!

Криоперенос – ещё один способ ускорить беременность в результате ЭКО

Как показывает многолетняя практика «Клиники Пасман», беременность наступает чаще при использовании техники криопереноса. Попробуем?

После того, как эмбриологи соединят несколько яйцеклеток и сперматозоидов и получат здоровые и сильные эмбрионы, ваших будущих крошек отправят в специальный холодильник, где они будут дожидаться своего часа.

Час обычно наступает на следующий цикл после стимуляции. Когда гормональный фон будущей мамочки пришёл в норму, яичники восстановились, а эндометрий подготовлен, перенос эмбрионов окажется более продуктивным и беременность в криоцикле случится с большей вероятностью.

Бонус: таким образом можно осуществлять несколько попыток зачатия, выбирая периоды, когда организм к ним наиболее расположен.

Отложенное материнство – ЭКО для тех, кто знает, что всему своё время

Возможность замораживать яйцеклетки, сперматозоиды и эмбрионы, а также наличие идеальных условий для их хранения даёт «Клинике Пасман» право предлагать своим пациентам программу отложенного материнства.

Вы хотите стать мамой, но позже – когда построите карьеру, исследуете все страны, исполните заветные желания? Вы в самом расцвете сил, но понимаете, что так будет не всегда? Не стоит играть с судьбой – сохраните свой генетический материал и вернитесь к вопросу деторождения, когда сами этого захотите.

А ещё консервация клеток порой единственный шанс стать родителем, если сразила болезнь. «У пациентки выявлен рак молочной железы. Девушка молодая, жизнелюбивая – операция прошла успешно. Но теперь нужно идти на химиолечение, лучевую терапию, а это грозит последующим бесплодием. Вот почему наша умница уже вступила в протокол ЭКО и заморозила эмбрионы. Лет через 5 в период стойкой ремиссии сделаем перенос, и она сможет стать мамой даже в, казалось бы, безвыходной ситуации»,- приводит пример предусмотрительности акушер-гинеколог Воронова.

ЭКО с первой попытки – запросто! Со второй – ещё проще.

Если вы уже делали экстракорпоральное оплодотворение, но пока не стали родителями, не стоит опускать руки. В «Клинике Пасман» знают, как повернуть удачу лицом. Негативный опыт превратим в позитивный и, сделав все возможные выводы, подстелим соломки. Предусмотрим, учтём, пролечим, восстановим. И в следующий раз у вас точно получится!

Рецепт успешной беременности лично от Натальи Владимировны Вороновой

«Очень важен психоэмоциональный настрой. Мы работаем с парой, проектируя их мысли на положительный результат ЭКО, комфортную беременность, лёгкие роды. Иногда подключаем медицинского психолога – у нас работает замечательный специалист, кандидат медицинских наук Гунгер Наталья Николаевна. Заведомо настроить на беременность – вот наш девиз. Если пациентка ушла с уверенностью, что она будет беременная, так и случится.

Бывает и такое: мы так хорошо настраиваем на беременность, беря ответственность на себя, что женщины избавляются от стресса и… беременеют сами, естественным путём. Такое нередко случается! А мы только за – мы любой беременности рады, сами ли вы её получили или с помощью экстракорпорального оплодотворения.

Благодарим за помощь в сборе информации Воронову Наталью Владимировну, акушера-гинеколога «Клиники Пасман», доктора, которому доверяют семейное счастье сотни российских семей.

Общий протокол криоконсервации клеток млекопитающих

Введение и обзор

Клетки млекопитающих можно криоконсервировать (заморозить) и хранить в течение многих лет (обычно десять лет или более) путем тщательной подготовки и строгого соблюдения деталей следующих рекомендаций. Два подхода, описанные в этом протоколе, могут быть использованы для успешного криоконсервации первичных, нормальных или непрерывных (бессмертных) типов клеток из систем роста, зависимых от закрепления, или суспензий.(Это включает в себя В- и Т-лимфоциты, отделенные от крови, трансформированные или нет.) Основным условием криоконсервации и последующего восстановления клеток является медленное замораживание и быстрое оттаивание. Здесь описаны два наиболее часто используемых подхода для достижения этой цели.

Среда криоконсервации

Среда, используемая для криоконсервации клеток, всегда должна быть того же состава, что и среда, используемая для размножения клеток, с добавлением фетальной бычьей сыворотки (в случае бессывороточных культур) или повышением концентрации FBS, но для конечная концентрация не более 20%.FBS будет иметь тенденцию связывать токсичные материалы, которые могут высвобождаться, если некоторые клетки лизируются во время процесса замораживания или оттаивания. НЕОБХОДИМО также использовать криоконсервант. Может использоваться любой из двух (2). Основным выбором является стерильный диметилсульфоксид (ДМСО) с конечной концентрацией от 7% до 10%, при этом десять процентов являются оптимальными в большинстве случаев. Другой вариант — стерильный глицерин, также с конечной концентрацией 10% в среде. Глицерин следует использовать, если на тип клеток, подлежащих криоконсервации, может отрицательно или нежелательно повлиять воздействие сильных биполярных соединений, таких как ДМСО.Примером этого являются клетки HL-60, которые могут дифференцироваться при воздействии ДМСО. Если это может вызвать беспокойство или отрицательно повлиять на последующее культивирование, предпочтительным криоконсервантом будет глицерин. Важно: криоконсервант, особенно ДМСО, необходимо каждый раз использовать в свежем виде. Не покупайте большие объемы и продолжайте открывать и закрывать флакон с реагентом. Оба криоконсерванта будут либо быстро окислять, либо поглощать потенциально токсичные материалы из воздуха. Среду для криоконсервации следует каждый раз делать свежей только в объемах, необходимых для этого дня.Его можно хранить при + 4 ° C до одной недели и использовать обычно без проблем. Однако для чрезвычайно чувствительных культур, особенно для культур, которые были размножены в бессывороточной среде, может потребоваться очень свежая, чистая среда для криоконсервации.

Подготовка клеток

Зависимые от закрепления клетки следует собирать трипсинизацией (или другим подходящим методом), когда они только что конфлюэнтны, или раньше (идеальная конфлюэнтность 70-80%). Клетки суспензии следует собирать в середине логарифмической фазы роста, от 4 x 105 до 8 x 105 клеток / мл.Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и ресуспендируйте клетки в свежей среде криоконсервации до конечной концентрации 2-5 х 106 клеток / мл. Аликвотируйте 1 мл клеточной суспензии в криопробирки объемом 1,8 или 2,0 мл. Промаркируйте флаконы маркером или специальными криоэтикетками с лазерной печатью, устойчивыми к температурам жидкого азота, паровая фаза = от –150 ° C до –180 ° C и жидкая фаза = 196 ° C.

Замораживание клеток

Метод 1. Программируемая скорость замораживания

Если доступна морозильная камера с программируемой скоростью, этот подход, безусловно, лучший.Программа должна быть настроена на запуск при температуре клеток при запуске, либо при комнатной температуре, либо, если клетки необходимо выдерживать более часа после аликвотирования, но до начала процесса замораживания, поместите клетки на + 4 ° C и установите запуск программы при этой температуре. Затем программа должна снизить температуру со скоростью -1 ° C в минуту до –30 ° C. В диапазоне от –30 ° C до –50 ° C установите скорость охлаждения -0,5 ° C в минуту. После –50 ° C до ниже -100 ° C скорость может вернуться к –1 ° C в минуту.Когда температура в элементах ниже –100 ° C, их можно помещать непосредственно в хранилище с жидким азотом.

Способ 2. Изолированный контейнер

В случае отсутствия морозильника с программируемой скоростью, в качестве альтернативы клетки можно заморозить, поместив флаконы в изолированную стойку или аналогичный изолированный контейнер, который имеет как изоляцию стенок, так и изоляцию между пузырьками. Обычно используется штатив из пенополистирола, в который часто упаковывают центрифужные пробирки на 15 мл. Пробирки помещаются в отверстия, где были пробирки, а другая стойка помещается поверх пробирок, эффективно «сэндвич» между пробирками из пенополистирола. стойки.Таким образом, флаконы также изолированы друг от друга по отдельности. Это важная договоренность. Попытка состоит в том, чтобы осуществить контролируемый медленный процесс замораживания, описанный выше. Если поместить флаконы в описанную стойку, а затем поместить сборку в морозильную камеру с температурой –70 ° C или –80 ° C, пузырьки будут медленно замерзать из-за времени, необходимого для охлаждения окружающей изоляции. После того, как флаконы оставлены в стойке на ночь или даже на несколько дней, их можно перенести непосредственно в хранилище жидкого азота.

Размораживающие криоконсервированные клетки

Клетки, которые были надлежащим образом криоконсервированы, должны быть восстановлены следующим образом. Клетки быстро размораживают, погружая криопробирку, содержащую клетки, в предварительно нагретую стерильную бидистиллированную деионизированную воду (37 ° C, 1-2 мин), а затем суспензию клеток помещают в колбу для тканевых культур объемом 25 см2 в 10 мл подходящая питательная среда. Если клетки необходимо транспортировать из жидкого азота на какое-либо длительное расстояние или время, их следует транспортировать либо в жидком азоте, либо в сухом льду.Никогда не перевозите криоконсервированные клетки на обычном льду. Это приведет к медленному оттаиванию, что противоположно тому, что требуется для хорошего жизнеспособного восстановления. Через 24-48 часов среду можно заменить, чтобы удалить криоконсервант. Однако первоначальное разведение при первом посеве клеток приведет к снижению концентрации криопреобразователя ниже 1%, концентрации, которая обычно не будет токсичной или иным образом проблематичной для культуры.

Уведомление об отказе от ответственности.
Все методы, обсуждаемые в этом протоколе, использовались в TCF более 17 лет с замораживанием и последующим восстановлением более 99%.Этот протокол не защищен авторскими правами и не является собственностью. Его можно использовать и распространять без предварительного согласия TCF. Однако TCF не дает никаких гарантий, явных или подразумеваемых, что аналогичные результаты будут достигнуты при использовании этого протокола. Для получения дополнительной информации относительно любого аспекта этого протокола или услуг, предоставляемых TCF, пожалуйста, свяжитесь со Стивом Оглсби, директором, по телефону 919-966-4324.

Общий протокол TCF EBV.v10 07.02.2007

Протокол криоконсервации | Abcam

Криоконсервация — это метод замораживания клеток с сохранением их жизнеспособности до тех пор, пока они не разморозятся через несколько месяцев или лет.Клетки криоконсервированы, чтобы свести к минимуму генетические изменения и избежать потери из-за заражения. Лучше всего замораживать клетки, когда они достигают оптимальной скорости роста (3:22 ​​минуты).

Для получения дополнительных видео протоколов посетите нашу библиотеку видео протоколов здесь.

Распечатать этот протокол

Материалы и реагенты

  • Криопробирки 1–2 мл
  • Блок замораживания CoolCell® (BioCision)
  • Среда для замораживания

Криоконсервация

  1. Маркируйте криопробирки с датой, именем исследователя, ячейкой номер, номер пассажа и тип клетки (и любую другую полезную информацию, например генетические модификации).

  2. Если клетки прилипли, удалите среду для культивирования клеток, промойте в PBS, добавьте достаточно трипсина, чтобы покрыть клетки, и инкубируйте примерно 2 мин в инкубаторе 37 ° C. Ресуспендируют в среде для культивирования клеток и переносят в пробирку Falcon на 50 мл.

  3. Если клетки находятся в суспензии, просто перенесите нужный объем непосредственно в пробирку Falcon на 50 мл.

  4. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, чтобы определить их жизнеспособность. Жизнеспособность клеток для криоконсервации должна составлять не менее 75%.

  5. Центрифуга 5 мин при 1000 об / мин при комнатной температуре.

  6. Подготовьте среду для замораживания (Таблица 1).


    Обратите внимание, что ДМСО подходит не для всех типов клеток, поэтому в качестве альтернативы можно использовать глицерин.


  7. Удалите супернатант (сохраните его; он нужен для замораживающей среды, см. Таблицу 1) и осторожно ослабьте осадок.

  8. Добавьте среду для замораживания до необходимой плотности клеток. Для клеток млекопитающих это обычно 1000000 / мл замораживающей среды.Клетки не должны находиться при комнатной температуре в замораживающей среде более 10 мин.

  9. Разберите аликвоты 1 мл в криопробирки и закройте крышки.

  10. Перенесите криопробирки в CoolCell (при комнатной температуре) и поместите в морозильную камеру -80 ° C. CoolCell обеспечивает стабильное снижение температуры на 1 ° C / минуту.

  11. Примерно через 24 часа извлеките криопробирки из CoolCell и перенесите в жидкий азот для длительного хранения.

Тип культуры Замораживающая среда Примечания
Клетки, культивируемые в среде, содержащей FBS 90% FBS + 10% DMSO Хорошо перемешайте и прогрейте до 37 ° C. использовать.
Клетки, культивируемые в бессывороточной среде 90% кондиционированная среда + 10% ДМСО

Используйте супернатант со стадии центрифугирования (шаг 7).

Хорошо перемешайте и перед использованием нагрейте до 37 ° C.

Клетки, для замораживания которых требуется глицерин 90% FBS + 10% глицерин Хорошо перемешайте и нагрейте до 37 ° C перед использованием.

Таблица 1. Различные типы замораживающих сред для клеточных линий млекопитающих

Размораживание замороженных клеточных линий

  1. Извлеките криопробирку из хранилища с жидким азотом и поместите в водяную баню 37 ° C до тех пор, пока не разморозится примерно 80% (не размораживайте разморозить при комнатной температуре). Это не должно занять больше 1 минуты.
  2. С помощью пипетки перенесите содержимое флакона в пробирку Falcon на 15 мл, содержащую около 10 мл предварительно нагретой питательной среды.
  3. Центрифуга при 500–1000 об / мин в течение 5 мин, слить супернатант и ресуспендировать в соответствующем количестве среды для культивирования клеток.
  4. Перенесите клетки в культуральный сосуд и перенесите в инкубатор при 37 ° C.

Часто задаваемые вопросы

Почему я не могу дать клеткам оттаивать при комнатной температуре?

Клетки, как правило, следует разморозить как можно быстрее при температуре выше комнатной.Это потому, что медленный процесс оттаивания может повредить клетки.

Среда для замораживания содержит важные криозащитные агенты, такие как диметилсульфоксид (ДМСО), для предотвращения образования внутриклеточных и внеклеточных кристаллов льда, которые могут повредить клеточную мембрану и компоненты. У ДМСО есть недостаток, заключающийся в том, что он цитотоксичен, и поэтому клетки следует размораживать быстрее, чем это возможно при комнатной температуре, чтобы облегчить быстрое разведение и удаление ДМСО из непосредственного окружения клеток.

Медленный процесс замораживания (-1ºC в минуту) также помогает предотвратить образование внутриклеточных кристаллов льда, обеспечивая достаточный отток воды перед замерзанием. Быстрое размораживание клеток служит дополнительной цели предотвращения повреждения клеточной мембраны или компонентов кристаллами, образовавшимися в процессе замораживания.

Как долго я могу хранить криоконсервированные клетки?

Клетки, замороженные в соответствии с протоколами, можно хранить в жидком азоте в течение нескольких лет.В идеале замороженные клетки не следует хранить при -80 ºC в течение длительного времени (до одной недели) и по возможности их следует переносить в жидкий азот. Хранение клеток при -80ºC в течение длительного времени может поставить под угрозу жизнеспособность клеток.

Нашел этот протокол полезным? Ознакомьтесь с нашим протоколом подсчета ячеек.

морозильных камер | Thermo Fisher Scientific

Клеточные линии

в непрерывном культивировании могут страдать от нежелательных последствий, таких как генетический дрейф, старение и микробное заражение, и даже в самых хорошо функционирующих лабораториях может возникнуть сбой оборудования.Установленная клеточная линия является ценным ресурсом, а ее замена требует больших затрат времени и средств. Поэтому жизненно важно, чтобы они были заморожены и сохранены для длительного хранения. Правильно поддерживаемый замороженный фонд клеток — важная часть клеточной культуры.

Как только небольшой избыток клеток становится доступным в результате субкультивирования, лучший метод консервирования — хранить их в замороженном виде в виде исходного материала , защищать и не предоставлять для общего лабораторного использования. Рабочие запасы можно подготовить и пополнить из замороженных семенных запасов. Если запасы семян истощаются, криоконсервированные рабочие запасы могут затем служить источником для подготовки свежего семенного материала с минимальным увеличением числа поколений после первоначального замораживания.

Общий метод замораживания одинаков для прикрепленных и суспензионных клеток, за исключением того, что прикрепленные клетки необходимо удалить из планшетов для культивирования перед началом процедуры замораживания. Лучший метод криоконсервации культивируемых клеток — это их хранение в жидком азоте в полной среде в присутствии криозащитного агента, такого как диметилсульфоксид (ДМСО).Криозащитные агенты снижают точку замерзания среды и позволяют снизить скорость охлаждения, что значительно снижает риск образования кристаллов льда, которые могут повредить клетки и вызвать их гибель.

Примечание: Известно, что раствор ДМСО способствует процессу проникновения органических молекул в ткани. Обращайтесь с реагентами, содержащими ДМСО, используя оборудование и методы, соответствующие опасностям, создаваемым такими материалами. Утилизируйте реагенты в соответствии с местными правилами.

Среда для замораживания
Всегда используйте рекомендованную среду для замораживания для криоконсервации клеток. Среда для замораживания должна содержать криозащитный агент, такой как ДМСО или глицерин. Вы также можете использовать специально разработанную полную среду для криоконсервации, такую ​​как среда для замораживания культуры клеток Gibco Recovery или среда для криоконсервации Gibco Synth-a-Freeze.

  • Среда для замораживания восстановленных культур клеток — это готовая к использованию полная среда для криоконсервации культур клеток млекопитающих, содержащая оптимизированное соотношение фетальной бычьей сыворотки к бычьей сыворотке для повышения жизнеспособности клеток и восстановления клеток после оттаивания.
  • Synth-a-Freeze Криоконсервационная среда представляет собой стерильную среду для криоконсервации, не содержащую белков, химически определенную, содержащую 10% ДМСО, которая подходит для криоконсервации многих типов стволовых и первичных клеток, за исключением меланоцитов.
  • Сосуды для культивирования, содержащие культивируемые клетки в логарифмической фазе роста
  • Полная среда роста
  • Криозащитный агент, такой как ДМСО (используйте бутылку, отведенную для клеточных культур; открывайте только в вытяжном шкафу с ламинарным потоком) или замораживающую среду, такую ​​как Synth-a-Freeze Cryopreservation Medium или Recovery Cell Culture Freezing Medium
  • Одноразовые стерильные конические пробирки на 15 или 50 мл
  • Реагенты и оборудование для определения количества жизнеспособных и общих клеток (например,g., автоматический счетчик клеток Invitrogen Countess II FL или гемоцитометр, счетчик клеток и трипановый синий)
  • Стерильные криогенные флаконы для хранения (т. Е. Криопробирки)
  • Устройство для замораживания с регулируемой скоростью или камера изопропанола
  • Емкость для хранения жидкого азота

Для замораживания адгезивных клеток, помимо вышеуказанных материалов, вам понадобятся:

  • Сбалансированный солевой раствор, такой как фосфатно-солевой буфер Гибко Дульбекко (DPBS), не содержащий кальция, магния или фенолового красного
  • Реагент диссоциации, такой как трипсин или Gibco TrypLE Express, без фенолового красного

141

,15400054,150

,12604013,15250061, AMQAF1000, AMQAX1000,12648010, R00550

Следующий протокол описывает общую процедуру криоконсервации культивируемых клеток. Для получения подробных протоколов всегда обращайтесь к вкладышу продукта для конкретной ячейки.

  1. Приготовить замораживающую среду и хранить при температуре от 2 ° до 8 ° C до использования. Обратите внимание, что подходящая среда для замораживания зависит от клеточной линии.
  2. Для прикрепившихся клеток осторожно отделите клетки от сосуда для тканевой культуры, следуя процедуре, используемой во время пересева. Ресуспендируйте клетки в полной среде, необходимой для этого типа клеток.
  3. Определите общее количество клеток и процент жизнеспособности с помощью гемоцитометра, счетчика клеток и исключения трипанового синего или автоматического счетчика клеток Countess.В соответствии с желаемой плотностью жизнеспособных клеток рассчитайте необходимый объем замораживающей среды.
  4. Центрифугируйте суспензию клеток приблизительно при 100–200 × g в течение 5–10 минут. Слейте супернатант в асептических условиях, не нарушая клеточный осадок.

    Примечание. Скорость и продолжительность центрифугирования зависят от типа клеток.

  5. Ресуспендируйте осадок клеток в холодной замораживающей среде до рекомендуемой плотности жизнеспособных клеток для конкретного типа клеток.
  6. Распределите аликвоты клеточной суспензии в криогенные флаконы для хранения. По мере того, как вы их аликвотируете, часто и осторожно перемешивайте клетки для поддержания гомогенной клеточной суспензии.
  7. Заморозьте клетки в аппарате для замораживания с контролируемой скоростью, понижая температуру примерно на 1 ° C в минуту. В качестве альтернативы поместите криопробирки с клетками в камеру изопропанола и храните их при –80 ° C в течение ночи.
  8. Перенести замороженные клетки в жидкий азот и хранить их в газовой фазе над жидким азотом.

Следование приведенным ниже рекомендациям необходимо для криоконсервации ваших клеточных линий для будущего использования. Как и в случае с другими процедурами культивирования клеток, для достижения наилучших результатов мы рекомендуем строго следовать инструкциям, прилагаемым к вашей линии клеток.

  • Заморозьте образцы культивируемых клеток до высокой концентрации и как можно меньшего числа пассажей. Перед замораживанием убедитесь, что жизнеспособность клеток составляет не менее 90%.Обратите внимание, что оптимальные условия замораживания зависят от используемой клеточной линии.
  • Заморозьте клетки медленно, снижая температуру примерно на 1 ° C в минуту, используя крио-морозильник с контролируемой скоростью или контейнер для криогенного замораживания, такой как «Mr. Frosty », доступный от Thermo Scientific Nalgene labware (Nalge Nunc).
  • Всегда используйте рекомендованную морозильную среду. Среда для замораживания должна содержать криозащитный агент, такой как ДМСО или глицерин (см. What is Subculture? ).
  • Образцы клеток следует хранить в парообразном жидком азоте при температуре ниже –135 ° C.
  • Всегда используйте стерильные криопробирки для хранения замороженных клеток. Криопробирки, содержащие замороженные клетки, могут храниться погруженными в жидкий азот или в газовой фазе над жидким азотом (см. Примечания по безопасности ниже).
  • Всегда используйте средства индивидуальной защиты.
  • Все растворы и оборудование, контактирующие с клетками, должны быть стерильными. Всегда используйте надлежащую стерильную технику и работайте в вытяжном шкафу с ламинарным потоком.

Примечание по безопасности: Биологически опасные материалы должны храниться в газовой фазе над жидким азотом. Хранение закрытых криопробирок в газовой фазе исключает риск взрыва. Если вы используете жидкофазное хранилище, помните об опасности взрыва как стеклянных, так и пластиковых криопробирок и всегда надевайте защитную маску или очки.

Что нужно и что нельзя криосохранять клетки

Каковы плюсы и минусы использования криопробирок с внутренней и внешней резьбой?

Два варианта — это вопрос предпочтения.Некоторые исследователи выбирают дизайн с внешней резьбой, поскольку во флакон ничего не вставляется, что может помочь минимизировать загрязнение. Некоторые исследователи выбирают конструкции с внутренней резьбой, потому что они лучше подходят для их морозильных камер. Если кто-то использует автоматизацию, ему нужно подумать, какая резьба может использоваться с их захватами для инструментов.

Могу ли я использовать коробки из изолированного картона или пенополистирола в качестве морозильной камеры в морозильных камерах?

Эти самодельные устройства могут работать со многими линиями клеток.Однако они не всегда обеспечивают контролируемое, воспроизводимое или равномерное охлаждение. В результате могут возникнуть серьезные различия в жизнеспособности флаконов после размораживания. Поэтому мы не рекомендуем использовать для вашей культуры теплоизоляционный картон или пенополистирол.

Что вы думаете об альтернативах ДМСО для применения в клеточной терапии?

Криопротекторы (CPA) можно разделить на две группы: внутриклеточные и внеклеточные криопротекторы. Внутриклеточный CPA — это небольшая молекула, которая может проникать через клеточную мембрану.ДМСО, глицерин, этиленгликоль, пропиленгликоль и ряды клеточных банкиров относятся к внутриклеточным CPA. Внеклеточный CPA — это большая молекула, которую добавляют в раствор криопротектора. Сахароза, декстроза, метилцеллюлоза и поливинилпирролидон (ПВП) являются примерами (1) .

ДМСО успешно используется для криоконсервации различных типов клеток, включая стволовые клетки и дендритные клетки, которые используются для клеточной терапии. Согласно литературе (2,3) , многие авторы использовали замораживающие среды, содержащие FBS / HSA с 10% ДМСО.

Использование PVP было исследовано в качестве альтернативы криоконсервации с помощью ДМСО и фетальной телячьей сыворотки (FCS) в взрослых стволовых клетках, полученных из жировой ткани человека (4) . Автор заметил, что восстановление клеток, криоконсервированных в 10% PVP с сывороткой человека, было похоже на восстановление клеток, криоконсервированных в DMSO с сывороткой животных. Кроме того, они использовали метилцеллюлозу либо отдельно, либо в сочетании с пониженными уровнями ДМСО, что указывает на то, что 1% метилцеллюлоза дает сопоставимые результаты с концентрациями ДМСО до 2% во время анализа апоптоза.

  1. Криоконсервация и ее клиническое применение
  2. Криоконсервированные мезенхимальные стромальные клетки восприимчивы к Т-клеточному апоптозу, который частично устраняется лицензированием IFNγ
  3. Зрелая дендритная клетка, полученная из криоконсервированной незрелой дендритной клетки, демонстрирует нарушенную способность самонаведения и сниженные противовирусные терапевтические эффекты
  4. Криоконсервация стволовых клеток человека для клинического применения: обзор

У нас возникли проблемы с образованием колоний наших ИПСК после оттаивания.Как долго мы должны ждать образования колоний и считаете ли вы, что это проблема нашего протокола криоконсервации?

Криогенная консервация клеточных культур широко используется для поддержания резервных копий или резервов клеток без связанных с этим усилий и затрат на кормление и уход за ними. Успех процесса замораживания зависит от четырех критических областей:

  1. Хорошее состояние ячеек. iPSC следует кормить ежедневно перед криоконсервацией, чтобы добиться более здорового состояния. После пассирования клетки следует заморозить в течение 2-4 дней.Избыточный рост может снизить жизнеспособность после оттаивания. Перед криоконсервацией скопления клеток следует растворить. Криопротектор может быть трудно проникнуть в кластер клеток, что приводит к тому, что только небольшая часть клеток выживает после оттаивания. Правильно обработайте и аккуратно соберите культуры. При сборе ИПСК мы рекомендуем центрифугировать при 200-300 X g в течение 2 минут и осторожно работать с дозаторами. 1-2 x 10 6 клеток / мл — типичная плотность криоконсервации. Слишком высокая плотность может снизить жизнеспособность клеток.
  2. Правильное использование криозащитного средства. Самый распространенный криопротектор — ДМСО. Чаще всего используется конечная концентрация около 10%. Для криоконсервации ИПСК некоторые исследователи также склонны добавлять в замораживающую среду FBS или фиколл. На рынке также есть несколько коммерческих продуктов. Чтобы добиться высокой эффективности извлечения, исследователи должны использовать свежие средние материалы. Смесь криопротекторов следует приготовить в день эксперимента.
  3. Контролируемая скорость замораживания.Идеальная скорость охлаждения клеток составляет -1 ° C в минуту. Лучший способ контролировать скорость охлаждения — использовать электронные программируемые морозильные устройства. Чтобы контролировать стоимость, исследователи могут использовать Corning ® CoolCell ™. Когда клетки хранятся в криогенных флаконах Corning, флаконы можно помещать в контейнер CoolCell комнатной температуры. Поместите контейнер CoolCell вертикально в морозильную камеру с температурой -80 ° C или в камеру хранения сухого льда.
  4. Хранение в надлежащих криогенных условиях. Морозильники с жидким азотом позволяют хранить в паровой фазе над жидкостью при температуре от -140 ° C до -180 ° C.Использование парофазного хранилища значительно снижает вероятность взрыва негерметичных флаконов или ампул при извлечении.

При оттаивании ИПСК:

  1. Клетки следует быстро разморозить, поместив криопробирки в водяную баню с температурой 37 ° C.
  2. С помощью пипетки перенесите суспензию клеток в 10-кратный объем среды по капле. Операция должна быть щадящей и медленной.
  3. Диапазон плотности посева для каждой 35-миллиметровой лунки (6-луночный планшет) составляет от 2х10 5 до 1х10 6 жизнеспособных клеток.Клетки могут прикрепиться к пластине с покрытием Corning Matrigel ® через 30 минут после оттаивания. 70-80% слияния может наблюдаться через 24-48 часов после посева.

У нас сейчас проблемы с получением жидкого азота. Есть ли у вас предложения, как хранить наши hiPSC без него?

В долгосрочной перспективе я бы посоветовал хранить iPCS в паровой фазе над жидким азотом. Температура паровой фазы может достигать от -140 ° C до -180 ° C. Хотя -80 ° C является еще одной обычной температурой для хранения клеток млекопитающих, клетки имеют тенденцию к снижению жизнеспособности в течение нескольких месяцев хранения.Исследования показали, что добавление 10% фиколла 70 к криопротектору, содержащему 10% ДМСО, позволяет замораживать клетки при -80 ° C в течение одного года без потери жизнеспособности по сравнению с хранением жидкого азота. Вы можете найти более подробную информацию в документе ниже.

Эффективная долговременная криоконсервация плюрипотентных стволовых клеток при −80 ° C

Наша лаборатория работает над уменьшением содержания ДМСО в наших средах для криоконсервации гепатоцитов. Есть ли у вас какие-либо рекомендации по снижению ДМСО вместе с самыми низкими процентами, которые вы видели для этого приложения.

Есть много сообщений о криоконсервации гепатоцитов разных видов, таких как мыши, обезьяны, собаки, крысы и люди. По данным многих литературных источников, авторы использовали 10-20% ДМСО для криоконсервации гепатоцитов. 10% ДМСО — это наиболее распространенная концентрация как минимум криопротектора для гепатоцитов. Если вас беспокоит жизнеспособность клеток, вы можете попытаться добавить олигосахариды в качестве добавки в замораживающую среду, которая содержит 10% ДМСО (1) . Авторы наблюдали, что использование олигосахаридов привело к наибольшему повышению жизнеспособности клеток с использованием метода исключения трипанового синего (TB).Кроме того, группа исследователей из Швеции оценила жизнеспособность клеток гепатоцитов с помощью STEM-CELLBANKER TM (CB), который представляет собой раствор для криоконсервации без ксенонов, содержащий 10% ДМСО, глюкозу и безводную декстрозу, сравнивая стандартную среду 12% DMSO-UW . (2) . Они наблюдали более высокую жизнеспособность клеток в протоколах CB, чем DMSO-UW в гепатоцитах.

(1) Повышение жизнеспособности гепатоцитов после криоконсервации путем добавления длинноцепочечных олигосахаридов в замораживающую среду у крыс и людей
(2) Улучшенная криоконсервация гепатоцитов человека с использованием нового раствора криопротектора, не содержащего ксено

Я знаю, что это обычная проблема, но есть ли у вас рекомендации по повышению жизнеспособности клеток после размораживания?У нас были разные успехи, и я не знаю почему.

Существует множество факторов, которые имеют решающее значение для успешной криоконсервации, такие как сбор клеток, криозащитные агенты (CPA), емкости для хранения, скорость охлаждения, криогенное хранение и оттаивание. К сожалению, мы обычно замечаем проблемы жизнеспособности клеток, которые связаны с криоконсервацией после этапов размораживания и посева. Я бы предложил четыре основных контрольных точки, которые необходимо учитывать для повышения жизнеспособности клеток. Во-первых, здоровье клеток и их плотность имеют решающее значение, когда клетки заморожены.Чем здоровее ваши клетки, тем выше их жизнеспособность после размораживания. Мы рекомендуем 2 x 10 6 ячеек для типичного криогенного флакона Corning (каталожный номер Corning 430661 или 430489). Если плотность клеток слишком высока, питательных веществ или CPA может быть недостаточно для поддержания здоровья клеток. Кроме того, перед замораживанием клетки необходимо избегать чрезмерного воздействия реагентов для диссоциации клеток или CPA и слишком длительного хранения при комнатной температуре во время сбора клеток. Во-вторых, когда вы переносите криогенные флаконы, содержащие ресуспендированные клетки с замораживающей средой, в морозильный контейнер, такой как Corning CoolCell ™ Container при -80 ° C, скорость охлаждения (-1 ° C в минуту) является важным фактором для замораживания клеток.Вам необходимо использовать подходящий морозильный контейнер, тип и концентрацию CPA во время замораживания клеток. В-третьих, вы не должны подвергать клетки воздействию высоких температур во время перевода в криогенное хранилище (-196 ° C). Наконец, необходимо быстро разморозить и удалить CPA должным образом, чтобы избежать токсичности или осмотического шока. Недавно я провел вебинар, посвященный общему руководству по криогенному хранению культур клеток животных. Пожалуйста, обратитесь к веб-семинару, который доступен на веб-сайте Corning, с особым вниманием к отметке времени 25:27, когда я расскажу о методологии устранения неполадок, которая может повысить вашу жизнеспособность.

(1) Общее руководство по криогенному хранению культур клеток животных
(2) Вебинар

Как следует повторно заморозить ячейки? Мы разморозили лимфоциты после того, как получили их из другой лаборатории, а затем попытались снова заморозить часть образца, чтобы использовать в более позднее время. Когда мы снова разморозили замороженные клетки, мы увидели очень низкую жизнеспособность по сравнению с клетками, которые размораживали только один раз. Этого следовало ожидать?

Несмотря на все наши усилия по оптимизации CPA и других многочисленных переменных в протоколе замораживания / оттаивания, криоконсервация является травмирующим процессом для клеток.Следовательно, следует ожидать некоторой потери жизнеспособности после процесса замораживания / оттаивания, а повторные циклы могут привести к прогрессирующей потере клеток. Вообще говоря, есть несколько факторов, которые необходимо учитывать при наблюдении за низкой жизнеспособностью клеток: здоровье и плотность клеток при замораживании, недопущение длительного воздействия CPA или комнатной температуры во время сбора урожая, контролируемая и соответствующая скорость охлаждения, избегание воздействия высоких температур во время переноса в криогенное хранение, быстрое размораживание и надлежащее удаление CPA.Мы описали это более подробно в предыдущем вопросе. Я также предлагаю вам также проверить жизнеспособность клеток под микроскопом перед замораживанием, чтобы проверить популяции мертвых клеток в ваших сосудах. Чтобы удалить мертвые клетки, вы можете вращать PBMC с низкоскоростным центрифугированием во время стадии промывки.
В частности, для PBMC может происходить прогрессирующая потеря жизнеспособности клеток по мере увеличения времени хранения (1) . Кроме того, на криоконсервацию влияет заболевание человека, от которого происходят PBMC.Согласно литературным данным (2) , PBMC от педиатрических пациентов, которые естественно инфицированы вирусом денге, показали снижение жизнеспособности клеток после криоконсервации по сравнению со свежими PBMC от здоровых детей с использованием метода исключения ТБ.
Я включил несколько протоколов PBMC для вашего обзора. Я бы обратил особое внимание на центрифугирование РВМС, концентрацию ДМСО и сыворотки, а также температуру среды замораживания (3,4) .
(1) Простой метод криоконсервации лимфоцитов
(2) Жизнеспособность и функциональность криоконсервированных мононуклеарных клеток периферической крови у детей денге
(3) Оптимизация мононуклеарных клеток периферической крови (PBMC) человека Криоконсервация
(4) Оптимизация восстановления замороженные мононуклеарные клетки периферической крови человека для проточной цитометрии

Из-за covid-19 мы быстро закрыли нашу лабораторию, и мы не смогли заморозить все наши клетки с помощью LN2.Как долго вы ожидаете, что ИПСК можно будет хранить при -80?

Воздействие хранения при -80 ° C на ячейки зависит от типа ячейки. Хранение от нескольких дней до месяцев повлияет на состояние клеток после размораживания, включая жизнеспособность, свойства или экспрессию генов. Стандартная замораживающая среда с 10% ДМСО недостаточна для защиты плюрипотентности клеток. Три дня хранения при -80 ° C могут вызвать потерю 50% живых клеток и 90% потерю экспрессии Oct-4. Если криоконсервация длится три месяца, повреждения усугубляются.Еще есть возможность дождаться восстановления плюрипотентности после оттаивания. Но даже 14-дневная культура после оттаивания не приведет к полному выздоровлению.
Исследователи также прилагают усилия для разработки лучших протоколов для улучшения долгосрочной криоконсервации при -80 ° C. Сообщалось, что 10% фиколла 70 в замораживающей среде может продлить срок хранения ИПСК при -80 ° C до одного года со сравнимой жизнеспособностью, эффективностью посева и плюрипотентным фенотипом по сравнению с хранением LN2. Улучшения также были достигнуты в красных кровяных тельцах и периферических гемопоэтических стволовых клетках.
Две приведенные ниже статьи могут помочь вам узнать больше об этой теме.
Криоконсервация путем медленного охлаждения ДМСО снижает выработку маркера плюрипотентности Oct-4 в эмбриональных стволовых клетках человека
Эффективное долгосрочное криоконсервация плюрипотентных стволовых клеток при -80 ° C

Вы знаете криопротектор, не содержащий ДМСО, который подходит для замораживания образцов тканей?

Хотя ДМСО является широко применяемым криопротектором, у этого соединения все еще есть некоторые недостатки, такие как неврологическая токсичность и генотоксичность.В случаях замораживания тканей исследователи хотели бы избегать использования ДМСО в качестве криопротектора, особенно для последующих клинических применений. Выбор альтернативных соединений зависит от тканевого происхождения и следующего применения. Многие альтернативы ДМСО были проверены при замораживании тканей, включая непроникающие криопротекторы (например, глюкоза, сахароза, галактоза или трегалоза) и внутриклеточные криопротекторы (например, этиленгликоль, пропиленгликоль, глицерин, формамид, метанол и бутандиол).Некоторые коммерческие продукты также доступны на рынке. Вы можете найти более подробную информацию в следующих ссылках.

Успешная криоконсервация цельного яичника овцы с использованием криопротектора, не содержащего ДМСО
Криоконсервация ткани пуповины человека без ДМСО
Криоконсервация ткани пуповины: краткий обзор

Каков наилучший метод размораживания образцов Т-клеток из нескольких лабораторий. Я не знаю каждого протокола замораживания, так что есть лучший универсальный метод?

Несколько протоколов криоконсервации были успешно зарегистрированы для Т-клеток.Тем не менее, лучший протокол криоконсервации ваших Т-клеток должен быть изменен вашим собственным тестированием, поскольку существует множество факторов для успешного замораживания клеток (пожалуйста, обратитесь к Вопросам № 7 и № 8 для получения подробной информации). В качестве криопротектора многие авторы использовали 5-10% ДМСО с фетальной телячьей сывороткой (FCS) или человеческим сывороточным альбумином (HAS), и они подчеркнули соответствующую скорость охлаждения (-1 ° C в минуту или медленнее) Т-клеток ( 1,2,3). Обратите внимание, что «Имеются сообщения о потере ответа и снижении функций Т-клеток в замороженных клетках по сравнению со свежевыделенными клетками и потере распознавания антигена Т-клетками, которая увеличивается с увеличением времени замораживания» (4) .

(1) Криоконсервация первичных клеток млекопитающих
(2) Влияние различных скоростей охлаждения и оттаивания на качество криоконсервированных Т-клеток периферической крови человека
(3) Оптимизация и ограничения использования криоконсервированных мононуклеарных клеток периферической крови для функциональных и фенотипических Характеристика Т-клеток
(4) Быстрое размножение Т-клеток: эффекты культивирования и криоконсервации и важность краткосрочного восстановления клеток

Есть ли лучший способ подготовить образцы тканей для замораживания, если после оттаивания они будут подвергаться интенсивной визуализации? Также у вас есть рекомендации по размораживанию, когда будет визуализирован образец ткани?

Есть несколько принципов, на которые следует обратить внимание при замораживании тканей.Во-первых, ткани следует незамедлительно заморозить или зафиксировать, чтобы избежать морфологических искажений. Во-вторых, обязательно держите свежие салфетки на льду и обрабатывайте их как можно быстрее. В-третьих, предпочтителен меньший размер выборки. В-четвертых, держите образец сухим и избегайте слишком большого количества жидкости перед замораживанием. Размораживание образцов тканей следует производить быстро на водяной бане с температурой 37 ° C. Для некоторых тканей, кровеносных сосудов и костей регулирование скорости оттаивания может снизить хрупкость тканей. Помимо этого, криопротектор или процесс будут различаться в зависимости от органа.Вы можете найти более конкретные методы по ссылке ниже.

Криоконсервация композитных тканей

Могу ли я перенести клетки, хранившиеся при -80, в жидкий азот напрямую или мне нужно предпринять промежуточные шаги?

Как правило, криопробирки можно переносить при температуре от -80 ° C до -196 ° C непосредственно для длительного хранения.

Жизнеспособность штаммов базидиомицетов после криоконсервации: сравнение двух различных протоколов замораживания

  • Александр М., Daggett P.-M., Gherna R., Jong S.C., Simione F., Hatt H.: Американские методы сбора типовых культур I. Лабораторное руководство по консервации замораживания и сублимационной сушки. Американская коллекция типовых культур, Роквилл (США) 1980.

    Google ученый

  • Баттерфилд В., Джонг С.С., Александр М.Т .: Полипропиленовые флаконы для сохранения грибов в жидком азоте. Mycologia 70 , 1122–1124 (1978).

    Артикул

    Google ученый

  • Челлен М.П., Эллиотт Т.Д .: Ампулы из полипропиленовой соломки для хранения микроорганизмов в жидком азоте. 5 , 11–23 (1986).

    Артикул

    Google ученый

  • Хвостова В., Неруд Ф., Хомолка Л .: Жизнеспособность древесных базидиомицетов после криогенной консервации // Фолия Microbiol. 40 , 193–197 (1995).

    Артикул

    Google ученый

  • Эллиот Т.Дж .: Альтернативная ампула для хранения грибковых культур в жидком азоте // Trans.Brit.Mycol.Soc. 67 , 545–546 (1976).

    Google ученый

  • Heckley R.J .: Сохранение микроорганизмов. Adv.Appl.Microbiol. 24 , 1–53 (1978).

    Артикул

    Google ученый

  • Hoffmann P .: Криоконсервация грибов. World J.Microbiol.Biotechnol. 7 , 92–94 (1991).

    Артикул

    Google ученый

  • Хомолка Л .: К проблеме содержания и выращивания высших грибов // Фолия Микробиол. 21 , 189–190 (1976).

    Google ученый

  • Хомолка Л., Лиса Л., Эйхлерова И., Неруд Ф .: Криоконсервация некоторых штаммов базидиомицетов с использованием перлита. 47 , 307–313 (2001).

    Артикул
    CAS

    Google ученый

  • Hubálek Z.: Криоконсервация микроорганизмов. Academia, Прага 1996.

    Google ученый

  • Хван С.-У ​​.: Исследование сверхнизких температур для грибных культур — I. Оценка хранения жидкого азота для сохранения выбранных грибных культур. Mycologia 60 , 613–621 (1968).

    Артикул

    Google ученый

  • Hwang S.-W., Kwolek W.F., Haynes W.С .: Исследование сверхнизких температур для грибных культур — III. Жизнеспособность и скорость роста мицелиальных культур после криогенного хранения. Mycologia 68 , 377–387 (1976).

    Артикул

    Google ученый

  • Джонг С.К .: Сохранение культур, стр. 119–135 в книге «Биология и выращивание съедобных грибов» (С.С. Чанг, В.А. Хэй, ред.). Academic Press, New York 1978,

    Google ученый

  • Джонг С.К., Аткинс У. Б.: Сохранение, сбор и распространение культур, стр. 153–194 inFungi Pathogenic for Humans and Animals. Часть B, Патогенность и обнаружение II (Х.Д. Ховард, ред.). Марсель Деккер, Нью-Йорк, 1985.

    Google ученый

  • Jong S.C., Davis E.E .: Сохранение зародышевой плазмы съедобных грибов в культуре посредством криогенного хранения, стр. 213–225 inProc. Междунар. Symp. Научно-технические аспекты выращивания съедобных грибов.Государственный университет Пенны, Юниверсити-Парк (США) 1986.

    Google ученый

  • Моррис Дж. Дж., Смит Д., Колсон Дж. Э .: Сравнение изменений морфологии гиф при замораживании и жизнеспособности при оттаивании для двадцати видов грибов. Дж. Ген. Микробиол. 134 , 2897–2906 (1988).

    Google ученый

  • Нику-Паавола М.Л., Рааска Л., Итаваара М.: Обнаружение грибов белой гнили нетоксичным красителем Mycol.Res. 94 , 27–31 (1990).

    Артикул

    Google ученый

  • Прескотт Дж. М., Кернкамп М. Ф .: Генетическая стабильность Puccinia graminis f.sp. tritici при криогенном хранении // Растение Dis.Rep. 55 , 695–696 (1971).

    Google ученый

  • Смит Д. Хранение грибов в жидком азоте. TransBrit. Mycol.Soc. 79 , 415–421 (1982).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • Смит Д.: Использование криоконсервации для сохранения грибов ex-situ. Крио-Письма 19 , 79–90 (1998).

    Google ученый

  • Смит Д., Уорд С.М.: Примечания по сохранению грибов. CAB International Mycological Institute, Kew (UK) 1987.

    Google ученый

  • Сталперс Дж.A., de Hoog A., Vlug I.J .: Совершенствование техники соломы для сохранения грибов в жидком азоте. Mycologia 79 , 82–89 (1987).

    Артикул

    Google ученый

  • Стойчев И., Хомолка Л., Неруд Ф., Лиза Л .: Активность лигнинолитических ферментов в некоторых штаммах базидиомицетов белой гнили после восстановления после криоконсервации в жидком азоте. Антони ван Левенгук 73 , 211–214 ( 1998).

    PubMed
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • Холерс Л.А .: Хранение растительной ткани при низких температурах // Adv.Biochem.Eng. 18 , 102–150 (1980).

    Google ученый

  • Подготовка образцов из целых клеток с использованием измельчения сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной томографии

  • 1.

    Франк, Дж. Трехмерная электронная микроскопия макромолекулярных сборок: визуализация биологических молекул в их естественном состоянии (Oxford Scholarship, 2010).

  • 2.

    Ногалес, Э.И Шерес, С. Х. У. Х. У. Крио-ЭМ: уникальный инструмент для визуализации макромолекулярной сложности. Мол. Ячейка 58 , 677–689 (2015).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 3.

    Frank, J., ed. Электронная томография: методы трехмерной визуализации структур в клетке (Springer, 2006).

  • 4.

    Grimm, R., Typke, D., Bärmann, M. & Baumeister, W.Определение неупругой длины свободного пробега во льду путем исследования наклонных пузырьков и автоматического построения изображений наиболее вероятных потерь. Ультрамикроскопия 63 , 169–179 (1996).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 5.

    Pilhofer, M., Ladinsky, M. S., McDowall, A. W., Petroni, G. & Jensen, G. J. Микротрубочки в бактериях: древние тубулины создают гомолог из пяти протофиламентов эукариотического цитоскелета. PLoS Biol. 9 , e1001213 (2011).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 6.

    Биби М., Чо М., Стуббе Дж. И Дженсен Дж. Дж. Рост и локализация гранул полигидроксибутирата в Ralstonia eutropha. J. Bacteriol. 194 , 1092–1099 (2011).

    PubMed
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 7.

    Амат, Ф.и другие. Анализ неповрежденного поверхностного слоя Caulobacter crescentus методом криоэлектронной томографии. J. Bacteriol. 192 , 5855–5865 (2010).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 8.

    Szwedziak, P., Wang, Q., Bharat, T. A. M., Tsim, M. & Löwe, J. Архитектура кольца, образованного гомологом тубулина FtsZ при делении бактериальных клеток. Элиф 3 , e04601 (2014).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 9.

    Szwedziak, P., Wang, Q., Freund, S. M. V. & Löwe, J. FtsA образует актин-подобные протофиламенты. EMBO J. 31 , 2249–2260 (2012).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 10.

    Ху, Б., Лара-Техеро, М., Конг, К., Галан, Дж. Э. и Лю, Дж. Молекулярная архитектура in situ аппарата секреции сальмонелл типа III. Ячейка 168 , 1065–1074.e10 (2017).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 11.

    Яснин М. и соавт. Трехмерная архитектура актиновых филаментов в хвостах комет Listeria monocytogenes. Proc. Natl Acad. Sci. США 110 , 20521–20526 (2013).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 12.

    Брандт, Ф., Карлсон, Л.-А., Хартл, Ф. У., Баумейстер, В. и Грюневальд, К. Трехмерная организация полирибосом в интактных клетках человека. Мол. Cell 39 , 560–569 (2010).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 13.

    Ханейн Д. и Хорвиц А. Р. Структура адгезий клетка-матрица: новый рубеж. Curr. Opin. Cell Biol. 24 , 134–140 (2012).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 14.

    Asano, S. et al. Протеасомы. Молекулярный учет протеасом 26S в интактных нейронах. Наука 347 , 439–442 (2015).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 15.

    Strauss, M., Hofhaus, G., Schröder, R. & Kühlbrandt, W. Димерные ленты АТФ-синтазы формируют внутреннюю митохондриальную мембрану. EMBO J. 27 , 1154–1160 (2008).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 16.

    Дэвис, К. М. и др. Макромолекулярная организация АТФ-синтазы и комплекса I в целых митохондриях.Proc. Natl Acad. Sci. США 108 , 14121–14126 (2011).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 17.

    Дэвис К. М., Блюм Т. Б. и Кюльбрандт В. Консервативное расположение комплекса I и III2 in situ в суперкомплексах митохондриальной дыхательной цепи млекопитающих, дрожжей и растений. Proc. Natl Acad. Sci. США 115 , 3024–3029 (2018).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 18.

    Kim, S. J. et al. Интегративная структура и функциональная анатомия комплекса ядерных пор. Природа 555 , 475–482 (2018).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 19.

    Ли, С., Фернандес, Ж.-Дж., Маршалл, В. Ф. и Агард, Д. А. Трехмерная структура триплета базальных тел, обнаруженная с помощью электронной крио-томографии. EMBO J. 31 , 552–562 (2011).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 20.

    Bharat, T. A. M. et al. Структура незрелого ретровирусного капсида при разрешении 8А с помощью криоэлектронной микроскопии. Природа 487 , 385–389 (2012).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 21.

    Bui, K. H. H. et al. Комплексный структурный анализ каркаса комплекса ядерных пор человека. Ячейка 155 , 1233–1243 (2013).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 22.

    Pfeffer, S. et al. Структура олигосахарилтрансферазного комплекса млекопитающих в транслоконе нативного белка ER. Nat. Commun. 5 , 3072 (2014).

    PubMed
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 23.

    Маттей, С., Гласс, Б., Хаген, У. Дж. Х., Краусслих, Х. Г. и Бриггс, Дж. А. Г. Структура и гибкость конических капсидов ВИЧ-1, определенные в интактных вирионах. Наука 354 , 1434–1437 (2016).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 24.

    Schur, F. K. M. et al. Атомная модель капсида-SP1 ВИЧ-1 выявляет структуры, регулирующие сборку и созревание. Наука 353 , 506–508 (2016).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 25.

    Додонова С.О. и др. Структура 9Å оболочки COPI показывает, что ГТФаза Arf1 занимает два контрастирующих молекулярных окружения.Элиф 6 , e26691 (2017).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 26.

    Beck, M. & Hurt, E. Комплекс ядерных пор: понимание его функции через структурное понимание. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 18 , 73–89 (2017).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 27.

    Zuber, B. et al. Прямая визуализация внешней мембраны микобактерий и коринебактерий в их естественном состоянии.J. Bacteriol. 190 , 5672–5680 (2008).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 28.

    Salje, J., Zuber, B. & Lowe, J. Электронная криомикроскопия E. coli выявляет пучки нитей, участвующие в сегрегации плазмидной ДНК. Наука 323 , 509–512 (2009).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 29.

    Studer, D., Klein, A., Iacovache, I., Gnaegi, H., Zuber, B. Новый инструмент, основанный на двух микроманипуляторах, облегчает работу с ультратонкими лентами криосекций. J. Struct. Биол. 185 , 125–128 (2014).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 30.

    Schur, F. K. M. et al. Структура незрелого капсида ВИЧ-1 в интактных вирусных частицах с разрешением 8,8 Å. Природа 517 , 505–508 (2014).

    PubMed
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 31.

    Бриггс, Дж. А. Г. Структурная биология in situ — потенциал усреднения субтомограмм. Curr. Opin. Struct. Биол. 23 , 261–267 (2013).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 32.

    Delarue, M. et al. mTORC1 контролирует разделение фаз и биофизические свойства цитоплазмы путем настройки скученности. Ячейка 174 , 338–349.e20 (2018).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 33.

    Turoňová, B., Schur, F. K. M., Wan, W. & Briggs, J. A. G. Эффективная коррекция 3D-CTF для криоэлектронной томографии с использованием NovaCTF улучшает разрешение усреднения субтомограммы до 3,4 Å. J. Struct. Биол. 199 , 187–195 (2017).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 34.

    Mosalaganti, S. et al. Архитектура in situ комплекса ядерных пор водорослей. Nat. Commun. 9 , 2361 (2018).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 35.

    Марко, М., Хсие, К., Шалек, Р., Франк, Дж. И Маннелла, К. Разжижение замороженных гидратированных биологических образцов сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной микроскопии. Nat. Методы 4 , 215–217 (2007).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 36.

    Rigort, A. et al.Микрообработка эукариотических клеток сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной томографии. Proc. Natl Acad. Sci. США 109 , 4449–4454 (2012).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 37.

    Вилла, Э., Шаффер, М., Плитцко, Дж. М. и Баумейстер, В. Открытие окон в ячейке: измельчение сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной томографии. Curr. Opin. Struct. Биол. 23 , 771–777 (2013).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 38.

    Martynowycz, M. W., Zhao, W., Hattne, J., Jensen, G. J. и Gonen, T. Сбор данных микроЭД непрерывного вращения для кристаллов любого размера, измельченных ионным пучком. Структура 27 , 545–548.e2 (2019).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 39.

    Medeiros, J. M. et al. Надежный рабочий процесс и оборудование для измельчения крио-сфокусированным ионным пучком образцов для электронной криотомографии. Ультрамикроскопия 190 , 1–11 (2018).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 40.

    de Winter, D. A. M. et al. Контроль целостности замороженно-гидратированных стекловидных пластин на месте, полученных с помощью сканирующего электронного микроскопа с криофокусированным ионным пучком. J. Struct. Биол. 183 , 11–18 (2013).

    PubMed
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 41.

    Rigort, A. et al. Инструменты микрообработки и соответствующие подходы для криоэлектронной томографии клеток.J. Struct. Биол. 172 , 169–179 (2010).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 42.

    Hayles, M. F. et al. Изготовление замороженно-гидратированных пластинок стекловидного тела из клеток для криоэлектронной микроскопии. J. Struct. Биол. 172 , 180–190 (2010).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 43.

    Ван, К., Странк, К., Чжао, Г., Грей, Дж. Л.И Чжан П. Определение трехмерной структуры нативных клеток млекопитающих с использованием крио-FIB и криоэлектронной томографии. J. Struct. Биол. 180 , 318–326 (2012).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 44.

    Hsieh, C., Schmelzer, T., Kishchenko, G., Wagenknecht, T. & Marko, M. Практический рабочий процесс крио-сфокусированного ионного луча измельчения тканей и клеток для крио-ТЕМ-томографии. J. Struct.Биол. 185 , 32–41 (2014).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 45.

    Harapin, J. et al. Структурный анализ многоклеточных организмов с помощью криоэлектронной томографии. Nat. Методы 12 , 634–636 (2015).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 46.

    Zhang, J., Ji, G., Huang, X., Xu, W. & Sun, F. Усовершенствованный метод крио-FIB для изготовления замороженных гидратированных ламелей.J. Struct. Биол. 194 , 218–223 (2016).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 47.

    Schaffer, M. et al. Техника извлечения крио-ФИБ позволяет крио-ЭТ с молекулярным разрешением в нативной ткани Caenorhabditis elegans. Nat. Методы 16 , 757–762 (2019).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 48.

    Rubino, S. et al.Специфический для конкретной площадки метод вывода сфокусированного ионного пучка для крио-просвечивающей электронной микроскопии. J. Struct. Биол. 180 , 572–576 (2012).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 49.

    Wagenknecht, T., Hsieh, C. & Marko, M. Ультраструктура соединения триады скелетных мышц с помощью фокусированного ионно-лучевого измельчения мышц и криоэлектронной томографии. Евро. J. Transl. Myol. 25 , 49–56 (2015).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 50.

    Mahamid, J. et al. Сфокусированный ионно-лучевой фрезерование и метод извлечения для специфической подготовки замороженных гидратированных ламелей многоклеточных организмов. J. Struct. Биол. 192 , 262–269 (2015).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 51.

    Khanna, K. et al. Молекулярная архитектура поглощения во время споруляции Bacillus subtilis. Элиф 8 , e45257 (2019).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 52.

    Чайкеератисак, В. и др. Транспортировка вирусного капсида по бегущим нитям тубулина в бактериях. Ячейка 177 , 1771–1780.e12 (2019).

    CAS
    PubMed
    Статья
    PubMed Central

    Google ученый

  • 53.

    Engel, B.D. et al. Поправка: нативная архитектура хлоропласта Chlamydomonas, выявленная с помощью криоэлектронной томографии in situ. Элиф 4 , e11383 (2015).

    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 54.

    Mahamid, J. et al. Визуализация молекулярной социологии на ядерной периферии клетки HeLa. Наука 351 , 969–972 (2016).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 55.

    Chaikeeratisak, V. et al. Сборка ядероподобной структуры во время репликации вируса в бактериях. Наука 355 , 194–197 (2017).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 56.

    Lopez-Garrido, J. et al. Транслокация хромосом раздувает предспоры Bacillus и влияет на клеточную морфологию. Ячейка 172 , 758–770.e14 (2018).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 57.

    Hampton, C.M. et al. Коррелированная флуоресцентная микроскопия и криоэлектронная томография инфицированных вирусом или трансфицированных клеток млекопитающих. Nat. Protoc. 12 , 150–167 (2017).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 58.

    Arnold, J. et al. Пробоподготовка криофокусированного ионного пучка в зависимости от места проведения под контролем трехмерной корреляционной микроскопии. Биофиз. J. 110 , 860–869 (2016).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 59.

    Watanabe, R. et al. Структура in situ препринта LRRK2, связанного с болезнью Паркинсона, доступна по адресу https://www.biorxiv.org/content/10.1101/837203v1 (2019).

  • 60.

    Guo, Q. et al.Структура in situ нейрональных агрегатов поли-GA C9orf72 выявляет рекрутирование протеасом. Ячейка 172 , 696–705.e12 (2018).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 61.

    Bäuerlein, F. J. B. et al. Архитектура in situ и клеточные взаимодействия включений polyQ. Ячейка 171 , 179–187.e10 (2017).

    PubMed
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 62.

    Ader, N. R. et al. Молекулярные и топологические реорганизации во взаимодействии митохондриальной архитектуры во время bax-опосредованных этапов апоптоза. Элиф 8 , e40712 (2019).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 63.

    Weiss, G. L., Kieninger, A. K., Maldener, I., Forchhammer, K. & Pilhofer, M. Структура и функция бактериального аналога щелевого соединения. Ячейка 178 , 374–384.e15 (2019).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 64.

    Rast, A. et al. Биогенные участки тилакоидов цианобактерий образуют участки контакта с плазматической мембраной. Nat. Растения 5 , 436–446 (2019).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 65.

    Buckley, G. et al. Автоматизированная подготовка криоламеллы для высокопроизводительной структурной биологии in-situ.J. Struct. Биол. 210 , 107488 (2020).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 66.

    Zachs, T. et al. Полностью автоматизированный последовательный фрезерование сфокусированным ионным пучком для криоэлектронной томографии. Элиф 9 , e52286 (2020).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 67.

    Nannenga, B. L. & Gonen, T. MicroED: универсальный метод криоЭМ для определения структуры.Emerg. Вершина. Life Sci. 2 , 1–8 (2018).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 68.

    Lee, J. Z. et al. Криогенный сфокусированный ионный пучок для исследования анодов из металлического лития. ACS Energy Lett. 4 , 489–493 (2019).

    CAS
    Статья

    Google ученый

  • 69.

    Захман, М. Дж., Ту, З., Чоудхури, С., Арчер, Л.А. и Куркутис, Л. Ф. Крио-СТЭМ-картирование границ раздела твердое тело-жидкость и дендритов в литий-металлических батареях. Природа 560 , 345–349 (2018).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 70.

    Ладинский, М.С. Криосекция стекловидного тела с помощью микроманипуляторов и подготовка проб путем замораживания под высоким давлением. Методы Энзимол. 481 , 165–194 (2010).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 71.

    Ладинский, М. С., Пирсон, Дж. М., Макинтош, Дж. Р. Криосрезы стекловидного тела клеток при помощи микроманипулятора. J. Microsc. 224 , 129–134 (2006).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 72.

    Аль-Амуди, А., Норлен, Л. П. и Дубочет, Дж. Криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела нативных биологических клеток и тканей. J. Struct. Биол. 148 , 131–135 (2004).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 73.

    Аль-Амуди, А. и др. Криоэлектронная микроскопия срезов стекловидного тела. EMBO J. 23 , 3583–3588 (2004).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 74.

    Хси, К. Э., Лейт, А. Д., Маннелла, К. А., Франк, Дж. И Марко, М. К трехмерной визуализации с высоким разрешением нативных тканей млекопитающих: электронная томография замороженных гидратированных срезов печени крыс. J. Struct. Биол. 153 , 1–13 (2006).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 75.

    Bouchet-Marquis, C., Dubochet, J. & Fakan, S. Криоэлектронная микроскопия застеклованных срезов: новая проблема для анализа функциональной ядерной архитектуры. Histochem. Cell Biol. 125 , 43–51 (2006).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 76.

    Матиас, В. Р. Ф., Аль-Амуди, А., Dubochet, J. & Beveridge, T. J. Крио-трансмиссионная электронная микроскопия замороженных гидратированных срезов Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 185 , 6112–6118 (2003).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 77.

    McEwen, B. F., Marko, M., Hsieh, C.-E. И Маннелла, С. Использование замороженных гидратированных аксонем для оценки параметров визуализации и пределов разрешения в криоэлектронной томографии.J. Struct. Биол. 138 , 47–57 (2002).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 78.

    Pierson, J. et al. Совершенствование техники криосрезов стекловидного тела для криоэлектронной томографии: электростатический заряд для прикрепления сечения и создание перчаточного бокса с защитой от контаминации. J. Struct. Биол. 169 , 219–225 (2010).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 79.

    Ларабелл, К. А. и Ле Гро, М. А. Рентгеновская томография генерирует трехмерные реконструкции дрожжей Saccharomyces cerevisiae с разрешением 60 нм. Мол. Биол. Cell 15 , 957–962 (2004).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 80.

    Schneider, G. et al. Трехмерная клеточная ультраструктура, разрешенная с помощью рентгеновской микроскопии. Nat. Методы 7 , 985–987 (2010).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 81.

    Hagen, C. et al. Структурная основа образования пузырьков на внутренней ядерной мембране. Ячейка 163 , 1692–1701 (2015).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 82.

    Hagen, C. et al. Корреляционная VIS-флуоресценция и мягкая рентгеновская криомикроскопия / томография адгезивных клеток. J. Struct. Биол. 177 , 193–201 (2012).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 83.

    Hagen, C. et al. Мультимодальные наночастицы как маркеры выравнивания и корреляции в флуоресценции / мягкой рентгеновской криомикроскопии / томографии нуклеоплазматического ретикулума и апоптоза в клетках млекопитающих. Ультрамикроскопия 146 , 46–54 (2014).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 84.

    Вольф, С. Г., Хубен, Л. и Эльбаум, М. Крио-сканирующая трансмиссионная электронная томография застеклованных клеток.Nat. Методы 11 , 423–428 (2014).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 85.

    Wolf, S. G. et al. Трехмерная визуализация митохондриальных твердофазных запасов кальция в целых клетках. Элиф 6 , e29929 (2017).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 86.

    Schertel, A. et al. Cryo FIB-SEM: объемная визуализация клеточной ультраструктуры в нативных замороженных образцах.J. Struct. Биол. 184 , 355–360 (2013).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 87.

    Soto, G.E. et al. Последовательная секционная электронная томография: метод трехмерной реконструкции крупных структур. Neuroimage 1 , 230–243 (1994).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 88.

    Heymann, J. A. W. et al.Трехмерное изображение клеток и тканей в зависимости от места нахождения с помощью двухлучевого микроскопа. J. Struct. Биол. 155 , 63–73 (2006).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 89.

    Нараян К. и Субраманиам С. Сфокусированные ионные пучки в биологии. Nat. Методы 12 , 1021–1031 (2015).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 90.

    Xu, C. S. et al. Усовершенствованные системы FIB-SEM для получения трехмерных изображений большого объема. Элиф 6 , e25916 (2017).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 91.

    Денк, В. и Хорстманн, Х. Последовательная сканирующая электронная микроскопия поверхности блока для реконструкции трехмерной тканевой наноструктуры. PLoS Biol. 2 , e329 (2004).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 92.

    Helmstaedter, M. et al. Коннектомическая реконструкция внутреннего плексиформного слоя сетчатки мыши. Природа 500 , 168–174 (2013).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 93.

    Lam, S. S. et al. Направленная эволюция APEX2 для электронной микроскопии и бесконтактного мечения. Nat. Методы 12 , 51–54 (2015).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 94.

    Shu, X. et al. Генетически кодируемая метка для коррелированной световой и электронной микроскопии интактных клеток, тканей и организмов. PLoS Biol. 9 , e1001041 (2011).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 95.

    Martell, J. D. et al. Разработал аскорбатпероксидазу как генетически кодируемый репортер для электронной микроскопии. Nat. Biotechnol. 30 , 1143–1148 (2012).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 96.

    Ou, H. D. et al. ChromEMT: визуализация трехмерной структуры хроматина и его уплотнения в интерфазных и митотических клетках. Наука 357 , eaag0025 (2017).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 97.

    Сохацкий, К. А., Штенгель, Г., ван Энгеленбург, С. Б., Гесс, Х. Ф. и Тараска, Дж. У. Корреляционная флуоресценция сверхвысокого разрешения и просвечивающая электронная микроскопия с металлическими репликами. Nat. Методы 11 , 305–308 (2014).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 98.

    Han, Y. et al. Направленная эволюция расщепленной пероксидазы APEX2. ACS Chem. Биол. 14 , 619–635 (2019).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 99.

    Ngo, J. T. et al. Click-EM для визуализации метаболически меченных небелковых биомолекул. Nat.Chem. Биол. 12 , 459–465 (2016).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 100.

    Ariotti, N. et al. Ультраструктурная локализация белковых взаимодействий с использованием условно стабильных нанотел. PLoS Biol. 16 , e2005473 (2018).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 101.

    Ариотти, Н., Холл, Т. Э. и Партон, Р. Г. Корреляционное световое и электронно-микроскопическое обнаружение белков, меченных GFP, с использованием модульного APEX. Методы Cell Biol. 140 , 105–121 (2017).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 102.

    Партон, Р. Г. Двадцать лет движения: взгляд на клеточную электронную микроскопию 2020 года. Трафик 21 , 4–5 (2019).

    Google ученый

  • 103.

    Toro-Nahuelpan, M. et al. Адаптация сеток для криоэлектронной микроскопии с помощью фото-микрорельефа для структурных исследований внутри клетки. Nat. Методы 17 , 50–54 (2019).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья
    CAS

    Google ученый

  • 104.

    Dubochet, J. et al. Криоэлектронная микроскопия застеклованных образцов. Q. Rev. Biophys. 21 , 129–228 (1988).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 105.

    Тейлор, К. и Глезер, Р. М. Ретроспектива раннего развития криоэлектронной микроскопии макромолекул и перспективы на будущее. J. Struct. Биол. 163 , 214–223 (2008).

    CAS
    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 106.

    Schaffer, M. et al. Оптимизированная подготовка проб криофокусированного ионного пучка для структурных исследований мембранных белков in situ.J. Struct. Биол. 197 , 73–82 (2017).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 107.

    Wolff, G. et al. Не забывайте о зазоре: швы с микродомпенсированием значительно уменьшают изгиб крио-ламелей, подвергнутых фрезерованию методом FIB. J. Struct. Биол. 208 , 107389 (2019).

    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • 108.

    Мастронард, Д. Н. Автоматизированная электронно-микроскопическая томография с надежным предсказанием движений образца.J. Struct. Биол. 152 , 36–51 (2005).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 109.

    Mastronarde, D. N. SerialEM: программа для автоматического серийного сбора данных по наклону на микроскопах Tecnai с использованием прогнозирования положения образца. Microsc. Микроанал. 9 , 1182–1183 (2003).

    Артикул

    Google ученый

  • 110.

    Hagen, W.J. H., Wan, W. & Briggs, J. A. G. Реализация схемы наклона криоэлектронной томографии, оптимизированной для усреднения субтомограмм с высоким разрешением. J. Struct. Биол. 197 , 191–198 (2017).

    PubMed
    PubMed Central
    Статья

    Google ученый

  • 111.

    Кремер, Дж. Р., Мастронарде, Д. Н. и Макинтош, Дж. Р. Компьютерная визуализация данных трехмерного изображения с использованием IMOD. J. Struct. Биол. 116 , 71–76 (1996).

    CAS
    PubMed
    Статья

    Google ученый

  • Подготовка образцов для ИГХ: парафин или замороженный продукт: Novus Biologicals

    Подготовка образцов для экспериментов IHC:

    Ткань подготавливают и консервируют путем заливки парафином или криоконсервации (замораживания). Часто метод консервации тесно связан с типом фиксации. Фиксированные формалином ткани после фиксации обычно заливают парафином, а замороженные срезы тканей фиксируют спиртом после криоконсервации.У каждого метода есть свои преимущества и недостатки. В то время как считается, что заливка парафином лучше сохраняет морфологические детали, считается, что криоконсервация лучше сохраняет экспрессию ферментов и антигенов. Оптимальный метод для каждого эксперимента должен определяться, среди прочего, с учетом природы антигена, его субклеточного расположения и желаемого метода обнаружения.

    Ткань, залитая парафином

    Замороженная ткань

    Фиксация Перед встраиванием После секционирования
    Разделение Микротом Криостат
    Хранилище Долгосрочный, несколько лет при комнатной температуре Кратковременно, 1 год при -80 ° C
    Преимущества Сохраняет морфологию тканей Сохраняет функцию ферментов и антигенов
    Ограничения Сверхфиксация может замаскировать эпитоп Образование кристаллов льда может негативно повлиять на структуру тканей

    Ткань с парафином

    Следует ли закрепить ткань перед заливкой в ​​парафин? Лучший способ сохранить ткани в течение длительного времени — парафиновая заливка.Незамедлительная перфузия или погружение ткани в фиксатор перед заделкой необходимы для предотвращения разрушения ткани и обеспечения сохранности.

    Как долго я должен фиксировать ткань перед заливкой? Для достижения наилучших результатов ткань фиксируется от 4 до 24 часов. Фиксация ткани в течение более 24 часов может привести к чрезмерной фиксации, маскированию антигена и ограничению связывания антитела с эпитопом при окрашивании ИГХ.

    Следует ли обезвоживать ткань перед заливкой в ​​парафин? Несмешиваемость парафина и воды требует обезвоживания тканей перед добавлением расплавленного парафина.Погружение ткани в увеличивающуюся концентрацию спирта приводит к проникновению спирта в ткань и замене воды спиртом. Поскольку спирт сжимает и затвердевает ткани из-за обезвоживания, необходимо внимательно следить за продолжительностью погружения. После обезвоживания погружение в ксилол удаляет излишки или остатки спирта, и ткань готова для заливки.

    До какой температуры следует нагревать парафин? Обычно парафин нагревают до 60 ° C для заливки, добавляют в ткань, а затем дают ему затвердеть в течение ночи.

    Можно ли хранить залитую парафином салфетку при комнатной температуре? Ткани, залитые в парафиновые блоки или залитые в парафин тканевые срезы на предметных стеклах, можно хранить при комнатной температуре.

    Протоколы ИГХ окрашивания срезов тканей, залитых парафином:

    Замороженная ткань

    Как мне заморозить образцы тканей? Замороженную ткань готовят путем погружения ткани в изопентан или жидкий азот.Быстрое замораживание также используется для замораживания тканей.

    Когда я могу исправить мои образцы, если во время криоконсервации? После криоконсервации и срезов ткани предметные стекла вынимают из морозильника и дают нагреться до комнатной температуры. Затем предметные стекла погружают в фиксатор (обычно спирт или ацетон).

    Следует ли мне выполнить этап поиска антигена на замороженных тканях? Фиксация в спирте позволяет избежать необходимости извлечения эпитопа, когда ткань фиксируется формальдегидом.